realtimeprimers qPCR 預(yù)混液簡(jiǎn)介

qPCR Master Mix- 新的高性能快速綠色 qPCR Blue Master Mixes

qPCR 預(yù)混液 AzuraQuant™ Green 和 Probe Fast qPCR 預(yù)混液用于實(shí)時(shí) PCR 實(shí)時(shí) PCR 引物酶：AzuraQuant™ Green Fast qPCR 預(yù)混液是一種即用型 2x 預(yù)混液，用于實(shí)時(shí)定量 PCR 分析，其中嵌入染料-基于檢測(cè)提供了擴(kuò)增后熔解曲線的選項(xiàng)。該系統(tǒng)包含 Vivid-Green™ 染料，這是一種新型熒光 DNA 結(jié)合染料，與 SYBR® Green 相比，它在與雙鏈 DNA 結(jié)合時(shí)產(chǎn)生最小的 PCR 抑制和更強(qiáng)的熒光。 AzuraQuant™ Green Fast qPCR Mix 包含 Azura HS Taq DNA 聚合酶、優(yōu)化的緩沖化學(xué)成分和專有的 DNA 結(jié)合染料，可提供穩(wěn)健的實(shí)時(shí) PCR，具有更早的定量循環(huán)值 (Ct) 和廣泛的檢測(cè)范圍，從而提高靈敏度、速度、可靠性和再現(xiàn)性。AzuraQuant™ Green Fast qPCR Mix 幾乎不需要優(yōu)化，可用于量化任何 DNA 模板，包括 cDNA、基因組 DNA 和低拷貝病毒靶標(biāo)。 AzuraQuant™ Probe Fast qPCR Mix 是一種即用型 2x 預(yù)混液，可用于實(shí)時(shí)定量 PCR 分析，專為探針檢測(cè)技術(shù)而設(shè)計(jì)，包括 TaqMan®、Scorpions® 和分子信標(biāo)探針。 為了確定儀器兼容性和最合適的 ROX™ 變體，請(qǐng)從下面的 AzuraQuant™ 產(chǎn)品中進(jìn)行選擇。

PCR 陣列 靶向?qū)崟r(shí) PCR 引物組庫(kù)（10 uM，40 ul） 最多可進(jìn)行 200 個(gè) PCR 陣列！每個(gè)陣列 2 美元！（基于 10 ul 反應(yīng)體積） 靈活設(shè)計(jì)自己的實(shí)驗(yàn) 微孔板包含 88 個(gè)靶向引物和 8 個(gè)管家基因引物組（每孔 20ul，10uM 濃度） 注意：引物文庫(kù)不提供引物序列

定量實(shí)時(shí) PCR 引物套裝

我們的目標(biāo)是提供一種具有成本效益的方法來(lái)驗(yàn)證 NGS 或微陣列數(shù)據(jù)并使用實(shí)時(shí) qPCR 測(cè)定定量基因表達(dá)

執(zhí)行多達(dá) 1000 次測(cè)定

提供有關(guān)最佳反應(yīng)條件的詳細(xì)信息 提供

引物序列?。?！

概述 - 定量“實(shí)時(shí)"PCR 或 qPCR

定量實(shí)時(shí) PCR *改變了我們測(cè)量核酸濃度的能力，并且是驗(yàn)證由微陣列分析和其他基因組學(xué)技術(shù)生成的表達(dá)數(shù)據(jù)的重要步驟。實(shí)時(shí) qPCR 儀器的開(kāi)發(fā)促進(jìn)了這一點(diǎn)，該儀器可測(cè)量反應(yīng)每個(gè)步驟或“實(shí)時(shí)"產(chǎn)生的 qPCR 產(chǎn)物的量。SYBR green 是目前流行的實(shí)時(shí) PCR 方法，因?yàn)樗鄬?duì)容易和可靠。在實(shí)時(shí) PCR 技術(shù)發(fā)展之前，定量測(cè)量需要建立多個(gè) PCR 反應(yīng)，以便在擴(kuò)增的線性階段捕獲 qPCR 產(chǎn)物。然后通過(guò)凝膠電泳或 HPLC 對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分離和定量。這些實(shí)驗(yàn)非常費(fèi)力，實(shí)現(xiàn)正確定量所需的操作次數(shù)增加了引入錯(cuò)誤的可能性。因此，可以在每個(gè)熱循環(huán)中測(cè)量 PCR 產(chǎn)物的實(shí)時(shí) PCR 儀器的開(kāi)發(fā)提高了定量 PCR 的簡(jiǎn)便性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。由于實(shí)時(shí) PCR 的發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)了各種應(yīng)用。這些包括 1) 驗(yàn)證通過(guò)微陣列分析或下一代測(cè)序 (NGS) 獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，2) DNA 拷貝數(shù)的測(cè)量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測(cè)和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達(dá)?？梢栽诿總€(gè)熱循環(huán)中測(cè)量 PCR 產(chǎn)物的實(shí)時(shí) PCR 儀器的開(kāi)發(fā)提高了定量 PCR 的簡(jiǎn)便性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。由于實(shí)時(shí) PCR 的發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)了各種應(yīng)用。這些包括 1) 驗(yàn)證通過(guò)微陣列分析或下一代測(cè)序 (NGS) 獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，2) DNA 拷貝數(shù)的測(cè)量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測(cè)和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達(dá)?？梢栽诿總€(gè)熱循環(huán)中測(cè)量 PCR 產(chǎn)物的實(shí)時(shí) PCR 儀器的開(kāi)發(fā)提高了定量 PCR 的簡(jiǎn)便性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。由于實(shí)時(shí) PCR 的發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)了各種應(yīng)用。這些包括 1) 驗(yàn)證通過(guò)微陣列分析或下一代測(cè)序 (NGS) 獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，2) DNA 拷貝數(shù)的測(cè)量，3) 病毒顆粒和潛在致命微生物的檢測(cè)和定量，4) 突變/SNP 分析，以及5）miRNA表達(dá)。

通常，實(shí)時(shí) PCR 協(xié)議類似于標(biāo)準(zhǔn) PCR 反應(yīng)。同樣的問(wèn)題也適用于產(chǎn)生干凈的模板、設(shè)計(jì)引物和優(yōu)化反應(yīng)條件。主要區(qū)別在于加入了嵌入劑（例如 SYBR green）或使用熒光引物檢測(cè) PCR 產(chǎn)物。在典型的反應(yīng)中，qPCR 產(chǎn)物以指數(shù)方式產(chǎn)生。因?yàn)樽銐虻漠a(chǎn)品需要幾個(gè)循環(huán)才能很容易檢測(cè)到，所以熒光與循環(huán)數(shù)的關(guān)系圖呈現(xiàn)出 S 形外觀。在隨后的循環(huán)中，反應(yīng)底物耗盡，qPCR 產(chǎn)物不再加倍，曲線開(kāi)始變平。曲線上熒光量開(kāi)始迅速增加的點(diǎn)，通常比基線高幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差，稱為閾值循環(huán)（Ct 值）。Ct 與模板的關(guān)系圖是線性的，因此多個(gè)反應(yīng)之間的 Ct 值比較可以計(jì)算目標(biāo)核酸的濃度。這條線的斜率提供了 qPCR 效率的度量。

PCR產(chǎn)物可以通過(guò)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)定量或相對(duì)于對(duì)照基因進(jìn)行定量。基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí) PCR 定量可以利用質(zhì)粒 DNA 或其他形式的 DNA，其中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的絕對(duì)濃度是已知的。然而，必須確定的是，標(biāo)準(zhǔn)品的 PCR 效率與“未知"樣本的效率相同。在某些情況下，從純化的靶標(biāo)進(jìn)行 PCR 可能比使用復(fù)雜核酸混合物觀察到的更有效。相對(duì)定量方法稍微簡(jiǎn)單一些，因?yàn)樗枰獪y(cè)量管家或?qū)φ栈騺?lái)標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)基因的表達(dá)。然而，選擇合適的對(duì)照基因可能會(huì)導(dǎo)致問(wèn)題，因?yàn)樗鼈儾灰欢ㄔ谒形粗獦颖局芯缺磉_(dá)。

執(zhí)行實(shí)時(shí) PCR 的一個(gè)關(guān)鍵方面是從高純度的模板開(kāi)始。在處理一些生物樣本時(shí)，這可能具有挑戰(zhàn)性。幸運(yùn)的是，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多商業(yè)產(chǎn)品來(lái)促進(jìn)高純度核酸的分離。去除污染的苯酚和不需要的 DNA 是需要考慮的步驟。對(duì)于基因表達(dá)研究，必須使用高純度試劑和多次重復(fù)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，因?yàn)榇瞬襟E可能會(huì)在模板復(fù)制中引入可變性。逆轉(zhuǎn)錄可以在實(shí)時(shí) PCR 之前進(jìn)行，或者可以合并到擴(kuò)增程序中。