mdbioproducts常見實驗室應用程序的故障排除
洗滌技巧:
確保移液器的每個尖頭都正確分配或噴射瓶有足夠的壓力。清空孔中的內容物并用指示的洗滌緩沖液體積填充孔。倒出孔,倒置并在干凈的紙巾上吸干。如插入所示重復此過程。最后一次傾析后,倒置去除任何剩余的洗滌緩沖液,并將其吸干在干凈的紙巾上。不要讓孔靜置,按照插圖中的指示進行下一步。注意:如果在傾析時條帶變得松散,則在清洗和在干凈的水槽中潷析之前對條帶進行編號非常有用。
確保有適當?shù)恼婵展?。檢查所有插管或插腳是否正確分配和抽吸。通過抽吸或傾析清空孔。將每個孔填充到插入物中指示的適當體積。*吸出孔。去除緩沖液后,讓抽吸裝置留在孔中,不要過度抽吸孔。如插入物所示重復此過程,不要讓孔在最后一次抽吸后保持干燥。
移液技術:
確保您使用的移液器已校準,并且移液器吸頭正確且牢固地固定在移液器上。將移液器設置到所需的體積并用樣品或試劑預沖洗。緩慢向上吸取試劑,使移液器緩慢返回向上位置。稍等片刻,讓試劑在吸頭中達到體積平衡。將試劑緩慢分配到第一次停止,然后輕輕分配到第二次停止。將移液器保持在此位置,直到將其從儲液器或孔中取出,以避免將試劑吸回。當您取下移液器時,將吸頭向上拉到容器或孔的一側,以釋放可能在吸頭外側的任何液體。
ELISA 故障排除
許多因素會影響 ELISA 的性能。
IHC 故障排除
無染色
問題 | 可能的解決方案) | |
一抗和二抗可能不匹配。 | 建議二抗針對產生一抗的物種(例如,如果一抗是在小鼠中產生的,則使用抗小鼠二抗)。 | |
該抗體可能不適用于以天然(非變性)形式顯示蛋白質的 IHC 程序。 | 在非變性和變性蛋白質印跡上測試抗體,以確保抗體識別非變性抗原。 | |
二抗未避光保存。 | 建議避免將二抗暴露在光線下。 | |
沒有足夠的一抗與目標蛋白質結合。 | 減少抗體稀釋。 在 4°C 下孵育更長時間。 | |
感興趣的蛋白質并不大量存在于組織中。 | 運行陽性對照。 利用放大步驟可以幫助放大信號。 使用較低稀釋度的一抗。 | |
目標蛋白是核蛋白,抗體不能穿透細胞核。 | 為了促進細胞核的滲透,在封閉緩沖液和抗體稀釋緩沖液中加入透化劑。 | |
脫蠟可能不夠 | 將切片脫蠟時間更長。 使用新鮮制備的二甲苯。 | |
福爾馬林和多聚甲醛等固定劑可能會改變抗體識別的表位。 | 使用抗原修復方法揭露表位。 修復時間更短。 | |
PBS 緩沖液可能被細菌污染,這些細菌已經破壞了目標蛋白質。 | 在 PBS 抗體儲存緩沖液中使用防腐劑,如 0.01% 疊氮化物。 使用新鮮的無菌 PBS。 |
高背景
問題 | 可能的解決方案) | |
非特異性結合的阻斷可能是不夠的。 | 將切片的封閉潛伏期延長至 30 分鐘,將細胞培養(yǎng)延長至 1 小時。使用封閉劑,例如 10% 正常血清用于切片,1-5% BSA 用于細胞培養(yǎng)。 | |
一抗?jié)舛瓤赡芴摺?/td> | 將抗體滴定至更佳濃度,使用更多稀釋液孵育更長時間。這將提供更慢但更具體的綁定。 | |
二抗可能非特異性結合。 | 在沒有一抗的情況下運行二級對照。 | |
孵化溫度可能太高。 | 在 4°C 下孵育組織切片或細胞。 | |
組織未充分洗滌。 | 在所有步驟之間用 PBS *清洗 | |
內源性過氧化物酶是有活性的。 | 使用酶抑制劑,如堿性磷酸酶的左旋咪唑 (2 mM) 或過氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。 | |
福爾馬林和多聚甲醛等固定劑太強,可能已經改變了抗體識別的表位。 | 改變抗原修復方法。 減少抗原暴露溶液的孵育時間。 | |
應用了過多的基材。 | 減少底物孵育時間。 | |
色原與細胞中存在的 PBS 發(fā)生反應。 | 在與底物一起孵育之前,使用 Tris 緩沖液清洗切片。 | |
透化已經損壞了膜并去除了膜蛋白。 | 從緩沖液中去除通透劑。 |
非特異性染色
問題 | 可能的解決方案) | |
一抗或二抗的濃度可能太高。嘗試降低抗體濃度和/或潛伏期。 | 將信號強度與不表達目標的細胞進行比較。 | |
一抗是針對與染色組織相同的物種產生的(例如在大鼠組織上測試的大鼠一抗)。 | 當應用二抗時,它會與所有組織結合,因為它也是針對該物種產生的。使用針對與您的組織不同的物種產生的一抗/二抗。 | |
內源性過氧化物酶是有活性的。 | 使用酶抑制劑,如堿性磷酸酶的左旋咪唑 (2 mM) 或過氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。 | |
切片/細胞已變干。 | 將組織切片和細胞保持在高濕度下,不要讓它們變干。 |
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