Lactadherin是一種分布廣泛的糖蛋白（?50 kDa），最初由于與乳脂/脂質(zhì)小球膜相關(guān)而被表征。同義詞是PAS-6 / 7，牛相關(guān)黏蛋白，BA-46，P47和MFG-E8。內(nèi)分泌粘附素的結(jié)構(gòu)特征是存在兩個表皮生長因子（EGF）同源域（在第二個EGF域中具有RGD肽基序），以及兩個與凝集素域的盤狀蛋白家族具有同源性的C域，包括凝血因子V和VIII。乳桿菌粘附素以鈣非依賴性方式顯示優(yōu)先結(jié)合磷脂酰絲氨酸（L-形式），并且比膜聯(lián)蛋白V更特異性地結(jié)合。

純化的乳黏附素通過阻斷血液凝固蛋白的含磷脂酰絲氨酸的膜位點而起抗凝劑的作用（10）。熒光標(biāo)記的乳黏附素用作有核細胞和受刺激的血小板上暴露的磷脂酰絲氨酸的敏感探針（8、9）。乳粘附素將與磷脂酰絲氨酸含量低于膜聯(lián)蛋白V結(jié)合閾值的膜結(jié)合。

內(nèi)酯粘附素是從未經(jīng)巴氏消毒的牛乳中提純的（11）。

圖解應(yīng)用

上圖： K562細胞（上）和HL60細胞（下）在凋亡早期與FITC結(jié)合的乳黏附素（綠色）和Alexa-647結(jié)合的膜聯(lián)蛋白V（紅色）共同染色。膜聯(lián)蛋白被內(nèi)化在顆粒中，并且未檢測到染色細胞。參考：Shi，J.，Y. Shi，LN Waehrens，JT Rasmussen，CW Heegaard和GE Gilbert（2006）。“乳粘附素檢測到永生化白血病細胞經(jīng)歷程序性細胞死亡的早期磷脂酰絲氨酸暴露。” 細胞計數(shù)法A 69（12）：1193-201。版權(quán)所有2006。JohnWiley＆Sons，Inc.經(jīng)John Wiley＆Sons，Inc.許可轉(zhuǎn)載。

上圖：用星形孢菌素處理后2小時（上）和3小時（下），用FITC結(jié)合的乳黏附素染色的HeLa細胞。在細胞凋亡的早期，細胞具有小囊泡和長而細的附肢，可被乳黏附素染色。參考：Waehrens LN，Heeghaard，CW，Gilbert GE，Rasmussen JT。牛Lactadherin作為在凋亡HeLa細胞表面表達的磷脂酰絲氨酸的鈣獨立成像劑2009 J. Histochem。細胞化學(xué)。（2009年6月，ePub）。

以上：小鼠腸系膜靜脈血栓形成中的磷脂酰絲氨酸暴露。在即將腸系膜外在化之前，通過尾靜脈向小鼠分別給予1μg乳黏附素和膜聯(lián)蛋白V。腸系膜暴露于氯化鐵中，然后用鹽水/多聚甲醛灌注動物。用抗血纖蛋白原/血纖蛋白（左），抗血小板（中）和用堿性磷酸酶Vector Red底物顯影的抗漆蛋白抗體（右）對腸系膜的連續(xù)部分進行染色。一層纖維蛋白原/纖維蛋白（左，實心箭頭）覆蓋了壁畫出血（空心星）。血小板（中部）沿血栓的腔表面（空心三角形）散布，并在纖維蛋白原/纖維蛋白鏈延伸進入內(nèi)腔時散布。乳腺粘附素染色（右）在升高的內(nèi)皮表面上*（實心箭頭），包括靠近壁的粘附血小板。纖維蛋白鏈上的血小板未檢測到染色（空心箭頭）。（Shi J，Piper SW，Rasmussen JT，Heegaard CW，Gilbert GE。乳桿菌粘附素在體內(nèi)阻斷血栓形成和止血：與血小板磷脂酰絲氨酸的暴露相關(guān)。JThrombHaemost。2008年7月； 6（7）：1167-1174）。

使用BLAC-FITC的準(zhǔn)則：

FITC偶聯(lián)的牛乳粘附素（BLAC-FITC）作為100X儲備溶液（1.6微摩爾）在20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.4的緩沖液中提供，緩沖液中含1％（w / v）牛血清白蛋白和0.02％疊氮化納。假設(shè)大多數(shù)標(biāo)記反應(yīng)體積約為0.5ml，則一小瓶100X儲備材料足以進行200次標(biāo)記反應(yīng)。  此外，由于該產(chǎn)品帶有熒光標(biāo)記，因此應(yīng)避光。

對于典型的細胞染色實驗，通過離心收集凋亡細胞，然后重懸在生理緩沖液中，例如TBS（20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.4），HBS（20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.4）或PBS（4.3mM Na 2 HPO 4，1.47mM KH 2 PO 4，137毫米的NaCl，2.7mM的KCl，pH 7.4）中，以大約1×10的最終細胞計數(shù)6細胞/毫升?？梢酝ㄟ^胰蛋白酶消化收獲粘附細胞，但是在將最終懸浮液制成緩沖液之前，應(yīng)在培養(yǎng)基或緩沖液中至少洗滌一次。以每0.5ml細胞懸液5微升的速率將100X FITC共軛乳膠粘附原液添加到細胞懸液中。此時，可以通過添加PI至終濃度為0.5至1 µg / ml來開始進行碘化丙啶（PI）的可選染色。將反應(yīng)混合物在室溫下（避光）孵育5至10分鐘。

標(biāo)記的細胞可以通過多種方法進行分析，包括流式細胞術(shù)和熒光顯微鏡檢查。可以使用以下檢測器設(shè)置監(jiān)視熒光檢測：

            BLAC-FITC：Ex = 488 nm；Em = 530海里

            PI：Ex = 488 nm；Em = 640納米