ELISA原理：

該測(cè)定基于夾心ELISA技術(shù)，其中將對(duì)組裝的AAV衣殼上的構(gòu)象表位具有特異性的單克隆抗體（mab）涂在板上，并用于從樣品中捕獲AAV顆粒。

捕獲的AAV顆粒的檢測(cè)過(guò)程分為兩個(gè)步驟。

1. 生物素偶聯(lián)的單克隆抗體與捕獲的AAV顆粒結(jié)合。
2. 鏈霉親和素過(guò)氧化物酶綴合物與生物素分子反應(yīng)。底物的添加導(dǎo)致顯色反應(yīng)，該顯色反應(yīng)與特異性結(jié)合的病毒顆粒的量成比例。

AAV定量方法的比較：

每種常用的量化方法都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)：

• qPCR已被廣泛使用，但存在一些問(wèn)題，例如樣品制備，引物設(shè)計(jì)或PCR效率，這些問(wèn)題可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果之間的高度差異。
• 數(shù)字液滴PCR方法克服了qPCR的某些局限性。但是，由于樣品處理方案的不同，實(shí)驗(yàn)室之間的差異仍然可能發(fā)生。
• 如果使用可靠的參考材料，則斑點(diǎn)印跡是一種簡(jiǎn)單且定量的方法。然而，它通常受蛋白質(zhì)印跡的線性和動(dòng)態(tài)范圍的限制。

考慮到上述技術(shù)的實(shí)際缺點(diǎn)，目前常規(guī)的夾心ELISA在實(shí)驗(yàn)室間和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的變異以及易于使用方面似乎是*的。因此，它代表了可靠的和可重復(fù)的總rAVV衣殼滴度定量分析的格式。

改組/變異的AAV的使用：

改組/突變的AAV載體的識(shí)別取決于受改組/突變影響的特定衣殼區(qū)域。用于PROGEN的AAV ELISA的捕獲抗體結(jié)合特異性的（在某些情況下還定義為良好的構(gòu)象表位）。這些表位是由相應(yīng)的AAV血清型的衣殼組件產(chǎn)生的。ELISA可能識(shí)別您改組/突變的AAV載體的一個(gè)跡象是抗體結(jié)合表位的存在。然而，衣殼蛋白的蛋白質(zhì)序列的變化也可能影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象，因此，AAV衣殼上呈現(xiàn)的表位的構(gòu)象。這可能會(huì)影響抗體的結(jié)合親和力，并影響基于AAV ELISA試劑盒隨附的（非改組）試劑盒對(duì)照的效價(jià)測(cè)定。由于這些屬性在很大程度上取決于所執(zhí)行的特定改組/突變，因此PROGEN無(wú)法保證對(duì)改組/突變的AAV向量進(jìn)行成功且定量。即使在改組/突變的AAV衣殼上仍存在抗體結(jié)合表位，也需要針對(duì)您的特定AAV載體測(cè)試和優(yōu)化您的檢測(cè)方法。

PROGEN強(qiáng)烈建議您生產(chǎn)和校準(zhǔn)合適的（改組/突變）試劑盒對(duì)照品，以確保使用PROGEN ELISA試劑盒可靠地確定滴定的AAV載體的滴度。

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