表面抗體可用于鑒定抗原特異性雜交瘤細(xì)胞

原始B細(xì)胞在其表面表達(dá)具有相同氨基酸序列和抗原特異性的抗體的多個(gè)拷貝?？乖碳げ⒎只癁闈{細(xì)胞后，通過(guò)RNA剪接和初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄物的加工將膜抗體轉(zhuǎn)化為分泌的抗體，以去除疏水性跨膜錨。但是，RNA剪接在雜交瘤細(xì)胞中可能是不完整的，這將促進(jìn)選擇具有改變的結(jié)合特性的抗體。因此，我們使用免疫熒光染色來(lái)檢測(cè)活雜交瘤細(xì)胞質(zhì)膜上的免疫球蛋白。所有測(cè)試的分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，包括分泌IgG 1，IgG 2a，IgG 2b，IgG 3，與不表達(dá)免疫球蛋白的FO骨髓瘤細(xì)胞相比，IgM和IgM抗體在其表面顯示中等至高水平的膜免疫球蛋白（圖2A）。膜免疫球蛋白對(duì)雜交瘤細(xì)胞的功能活性通過(guò)用生物素化的聚乙二醇（PEG）或β-葡萄糖醛酸苷酶標(biāo)記Alexa Fluor 647-綴合的鏈霉親和素標(biāo)記3.3（抗PEG）和7G8（抗β-葡萄糖醛酸糖苷酶）雜交瘤細(xì)胞來(lái)檢查。 。3.3雜交瘤細(xì)胞特異性結(jié)合PEG但不結(jié)合β-葡萄糖醛酸苷酶，而7G8雜交瘤細(xì)胞結(jié)合β-葡萄糖醛酸苷酶但不結(jié)合PEG（圖2B），表明膜免疫球蛋白顯示出預(yù)期的抗原結(jié)合特異性。為了研究基于表面免疫球蛋白抗原結(jié)合的雜交瘤細(xì)胞高通量FACS是否可行，將7G8（抗β-葡糖醛酸糖苷酶）和3.3（抗PEG）雜交瘤細(xì)胞（99：1比例）的混合物染色，生物素化的PEG，然后與Alexa Fluor 647偶聯(lián)的抗生蛋白鏈菌素孵育?？梢郧宄貐^(qū)分兩個(gè)不同的細(xì)胞群，對(duì)應(yīng)于輸入的7G8細(xì)胞和3.3個(gè)細(xì)胞的比例（圖2C，左圖）。收集結(jié)合PEG的雜交瘤細(xì)胞并培養(yǎng)5天。對(duì)擴(kuò)增的雜交瘤細(xì)胞的分析表明它們可以結(jié)合PEG（圖2C，右圖），表明有效選擇了3.3種抗PEG雜交瘤細(xì)胞。我們得出結(jié)論，分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞在其表面上顯示出足夠的功能性免疫球蛋白，以允許鑒定和分離抗原特異性雜交瘤細(xì)胞。

圖2.雜交瘤細(xì)胞上的膜免疫球蛋白分析。（A）在用山羊抗小鼠Ig和兔抗山羊FITC染色細(xì)胞后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)在雜交瘤和FO骨髓瘤細(xì)胞上的膜結(jié)合免疫球蛋白。（B）在流式細(xì)胞儀上用生物素化的PEG或β-葡糖醛酸糖苷酶抗原，然后用Alexa Fluor 647-綴合的鏈霉親和素，在3.3抗-PEG和抗β-葡糖醛酸糖苷酶7G8雜交瘤細(xì)胞上檢測(cè)膜免疫球蛋白的功能性抗原結(jié)合。（C）以0.5：1生物素-PEG和Alexa Fluor 647-綴合的鏈霉親和素對(duì)以99：1比例混合的7G8抗-β-葡萄糖醛酸苷酶和3.3抗-PEG雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色。用熒光激活的細(xì)胞分選儀收集結(jié)合生物素-PEG的雜交瘤細(xì)胞（左圖），培養(yǎng)5天，然后用生物素-PEG和Alexa Fluor 647-鏈霉親和素染色（右圖）。

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SHM的可控誘導(dǎo)

我們構(gòu)建了組成型和誘導(dǎo)型載體，以允許在雜交瘤細(xì)胞中激活誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶（AID）的可控表達(dá)。一旦鑒定出具有所需特征的抗體變體，就將這些載體設(shè)計(jì)為促進(jìn)AID表達(dá)的終止。甲loxP位-flanked組成型表達(dá)盒（的pCMV-AID-loxP序列）（圖3A）被用于通過(guò)慢病毒感染穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)3.3抗-PEG雜交瘤細(xì)胞，使3.3 / loxP位-aid細(xì)胞。如eGFP報(bào)告蛋白的熒光所示，AID在3.3 / loxP -AID細(xì)胞中表達(dá)（圖3B，左側(cè)面板）。為了測(cè)試是否可以“按需”停止AID的表達(dá)，通過(guò)DNA電穿孔將pLM-mCherry-P2A-Cre質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到3.3 / loxP -AID細(xì)胞中。如通過(guò)mCherry表達(dá)可見(jiàn)，約23％的細(xì)胞表達(dá)Cre重組酶，對(duì)應(yīng)于顯示出降低的eGFP表達(dá)的細(xì)胞群（圖3B，中間圖），表明AID基因盒的缺失。可以通過(guò)FACS輕松分離eGFP陰性細(xì)胞（圖3B，右圖）。mCherry是瞬時(shí)表達(dá)的，因此在這些細(xì)胞中不再可檢測(cè)到。為了確認(rèn)AID基因的CRE依賴性缺失，從3.3細(xì)胞，3.3 / loxP -AID細(xì)胞或分選的Cre感染的3.3 / loxP制備的總細(xì)胞裂解液通過(guò)SDS-PAGE分離-AID細(xì)胞，并使用抗HA抗體通過(guò)Western印跡上的C端血凝素（HA）表位標(biāo)簽序列檢測(cè)AID。在3.3 / loxP -AID細(xì)胞中檢測(cè)到AID蛋白，但在Cre處理的3.3 / loxP -AID細(xì)胞中不存在AID蛋白（圖3C），這表明AID可以通過(guò)Cre重組酶介導(dǎo)的雜交瘤細(xì)胞缺失而穩(wěn)定表達(dá)并有條件地沉默。

圖3. AID的可控制表達(dá)。（A）pCMV-AID- loxP載體的示意圖。CMV立即早期啟動(dòng)子之后是小鼠激活誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶（AID）基因，HA表位標(biāo)簽，弗林蛋白酶/ 2A肽（F2A）雙順?lè)醋颖磉_(dá)接頭和eGFP報(bào)告基因。AID盒兩側(cè)有兩個(gè)loxP模體，用于Cre重組酶介導(dǎo)的基因切除。（B）在穩(wěn)定表達(dá)pCMV-AID- loxP（3.3 / loxP）的3.3雜交瘤細(xì)胞中的eGFP（y軸）和mCherry熒光（x軸）-AID細(xì)胞，左圖），以及通過(guò)DNA電穿孔用pLM-mCherry-P2A-Cre質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后（中圖），隨后對(duì)eGFP陰性細(xì)胞進(jìn)行了熒光激活的細(xì)胞分選（右圖）。（C）將由3.3、3.3 / loxP -AID或經(jīng)Cre處理的3.3 / loxP - AID細(xì)胞（經(jīng)分選）制備的細(xì)胞裂解物免疫印跡以檢測(cè)AID或微管蛋白上的HA表位標(biāo)簽，作為細(xì)胞上樣對(duì)照。（D）自動(dòng)調(diào)節(jié)pTetOn-AID質(zhì)粒由四環(huán)素應(yīng)答元件（TRE）啟動(dòng)子，AID基因，HA表位，弗林蛋白酶/ 2A肽（F2A）雙順?lè)醋颖磉_(dá)接頭，eGFP報(bào)告基因，IRES元件和rtTA-V14反式激活劑。（E）以指示的強(qiáng)力霉素濃度誘導(dǎo)48h的3T3 / TetOn-AID成纖維細(xì)胞中eGFP報(bào)告基因的流式細(xì)胞術(shù)直方圖。（F）DsRed2s在AID的熱點(diǎn)基序內(nèi)的核苷酸位置519處含有過(guò)早的終止密碼子。（G）在有（▲）或沒(méi)有（○）強(qiáng)力霉素的條件下培養(yǎng)用pDsRed2s轉(zhuǎn)導(dǎo)的3T3（■）或3T3 / TetOn-AID成纖維細(xì)胞，并通過(guò)FACS分析DsRed2的表達(dá)。顯示了表達(dá)紅色熒光（指示終止密碼子的突變）相對(duì)于時(shí)間的細(xì)胞分?jǐn)?shù)。

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還構(gòu)建了四環(huán)素誘導(dǎo)的AID表達(dá)盒（pTetOn-AID），作為AID表達(dá)可控誘導(dǎo)的替代方法。強(qiáng)力霉素可與rtTA-V14結(jié)合形成活性反式激活因子，從而在前饋環(huán)中啟動(dòng)由pTRE啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的DNA轉(zhuǎn)錄（圖3D）。16，17穩(wěn)定感染與多西環(huán)素的濃度梯度孵育兩天顯示的eGFP報(bào)告的劑量依賴性誘導(dǎo)，對(duì)應(yīng)于AID的誘導(dǎo)型表達(dá)的3T3 /堤-AID的細(xì)胞（圖3E）。為了檢查AID是否具有功能上足以誘導(dǎo)SHM的功能，將3T3或3T3 / TetOn-AID細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了DsRed2基因，其中在RGYW / WRCY AID共有熱點(diǎn)的情況下，酪氨酸173突變?yōu)殓晟K止密碼子主題（圖3F）。通過(guò)添加強(qiáng)力霉素而在SHM啟動(dòng)后，僅在3T3 / TetOn-AID轉(zhuǎn)染子中檢測(cè)到18 DsRed2熒光（圖3G）。我們得出的結(jié)論是，這些AID表達(dá)盒允許AID的可控表達(dá)以誘導(dǎo)SHM。

模擬體外生發(fā)中心反應(yīng)

我們?cè)?.3抗PEG雜交瘤細(xì)胞中表達(dá)AID，以分離在低溫下以高親和力與PEG結(jié)合的抗PEG抗體。這是通過(guò)擴(kuò)增3.3 / loxP -AID細(xì)胞以允許SHM，在冰上用熒光標(biāo)記的抗原（PEG）染色細(xì)胞，選擇通過(guò)FACS結(jié)合多PEG的雜交瘤細(xì)胞以及將所選細(xì)胞擴(kuò)增兩周以允許繼續(xù)進(jìn)行而完成的SHM。初的選擇是使用長(zhǎng)鏈多價(jià)PEG分子進(jìn)行的，但在隨后的細(xì)胞分選中，PEG的長(zhǎng)度和化合價(jià)逐漸降低。經(jīng)過(guò)五輪連續(xù)的細(xì)胞擴(kuò)增和分選后，將每輪分選后收集的雜交瘤細(xì)胞樣品用Alexa Fluor 647-PEG 5K染色并在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析（圖4A）。）。通過(guò)第五輪分選，與3.3 / loxP -AID雜交瘤細(xì)胞結(jié)合的Alexa Fluor 647-PEG 5K的平均熒光強(qiáng)度（MFI）為233，而親代3.3雜交瘤細(xì)胞的值為23.2，表明這些雜交瘤細(xì)胞表達(dá)具有增強(qiáng)的PEG親和力的抗體變體。在第五輪選擇后，通過(guò)3.3 / loxP -AID雜交瘤細(xì)胞的單細(xì)胞分選分離出的三個(gè)雜交瘤克?。?E3、1E10和2B5）觀察到了相似的高PEG結(jié)合（圖4B）。對(duì)來(lái)自3.3個(gè)亞克隆的免疫球蛋白可變區(qū)基因的序列分析表明，所有三種抗體變體在V H的構(gòu)架1（FR1）中均表現(xiàn)出共同的A23V突變鏈和VL鏈的CDR2中常見(jiàn)的N53K突變（圖4C）。此外，1E10和2B5抗體均在V L鏈的CDR2中具有A55P突變，而1E10抗體在V L鏈的CDR3中具有另一個(gè)突變S92T 。

圖4.通過(guò)模擬生發(fā)中心反應(yīng)分離溫度依賴性抗PEG抗體。（A）將3.3 / loxP -AID雜交瘤細(xì)胞富集用于結(jié)合Alexa Fluor 647-PEG探針（y軸）的細(xì)胞。還使用Alexa Fluor 405偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG Fc抗體（x軸）檢測(cè)了表面免疫球蛋白。將細(xì)胞培養(yǎng)2周，然后每輪分選約3×10 7個(gè)細(xì)胞（S0-S5）。結(jié)果顯示熒光標(biāo)記的PEG的結(jié)合對(duì)表面Ig的水平。（B）PEG-Alexa Fluor 647與三個(gè)雜交瘤克?。?E3、1E10和2B5）的結(jié)合，這些克隆是在選擇的第5輪后從雜交瘤群體中分離出來(lái)的（S5）。（C1E3、1E10和2B5抗體與親本3.3抗體的免疫球蛋白V H（上圖）和V L（下圖）基因序列的氨基酸序列和比對(duì)。使用網(wǎng)站http://www.bioinf。。ｏｒｇ.uk/abysis根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)61分配抗體框架區(qū)和CDR 。

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抗PEG抗體變體在低溫下選擇性結(jié)合PEG

我們?cè)u(píng)估了兩種3.3抗體變體（1E3和2B5）與包被在微量滴定板中的PEG（10000 Da）的溫度依賴性結(jié)合。2B5變體以比親本3.3抗體更大的表觀親和力結(jié)合PEG，而1E3在4°C時(shí)大約和3.3結(jié)合，但兩種變體抗體在25°C或37°C時(shí)都顯示出逐漸降低的與PEG的結(jié)合（圖5A） 。通過(guò)表面等離振子共振分析與PEG結(jié)合的抗體表明，在4°C下2B5和1E3與親本3.3抗體表現(xiàn)出相似的親和力，但在25°C下1E3和2B5對(duì)PEG的親和力降低了85和185倍分別與它們?cè)?°C下的親和力進(jìn)行比較（表1）。由于與PEG的結(jié)合力較弱，無(wú)法在37°C下確定1E3和2B5的親和力。對(duì)于涂在微量滴定板中的其他長(zhǎng)度的PEG，觀察到了類似的1E3和2B5溫度選擇性識(shí)別（圖S1）。我們還觀察到，與親本3.3抗體相比，1E3和2B5顯示出長(zhǎng)鏈PEG的結(jié)合增強(qiáng)，但與短PEG分子（即750 Da PEG）的結(jié)合降低。1E3和2B5抗體在高溫下并不是天生不穩(wěn)定的，因?yàn)榧词乖?7°C下孵育5 d后，它們?nèi)员Ａ袅送暾慕Y(jié)合活性（圖5B））。此外，通過(guò)差示掃描量熱法測(cè)定的1E3和2B5抗體的解鏈溫度（分別為73.6°C和74.2°C）實(shí)際上高于親本3.3抗體（70.8°C），表明1E8和2B5抗體熱穩(wěn)定的（圖5C）。這些結(jié)果表明，AID誘導(dǎo)的1E3和2B5抗體的免疫球蛋白V區(qū)基因突變賦予4°C優(yōu)先結(jié)合PEG的能力。

圖5.抗PEG抗體變體的溫度依賴性結(jié)合和穩(wěn)定性。（A）在溫度下，將梯度濃度的純化的3.3、1E3或2B5抗體添加到涂有線性氨基PEG（分子量10,000 Da）的微孔板孔中。1小時(shí)后，洗滌孔，并通過(guò)添加HRP綴合的驢抗小鼠IgG Fc抗體，然后添加ABTS底物來(lái)確定抗體結(jié)合。顯示了三次測(cè)定的平均吸光度值（405 nm）。將Bars，SD（B）3.3（■），1E3（○）和2B5（▲）抗體在與CH 3 -PEG 5k -NH 2結(jié)合之前，于37°C孵育的時(shí)間。通過(guò)ELISA在4°C下測(cè)定96孔微量滴定板中的DNA含量。顯示了通過(guò)測(cè)量ELISA中50％的大反應(yīng)確定的相對(duì)于零時(shí)抗體活性的不同時(shí)間的抗體活性。（n = 3）。棒，SD（C），如在PBS中以1℃/ min的加熱速率通過(guò)差示掃描量熱法所測(cè)量的，熱展開(kāi)為3.3（黑線），1E3（綠色短虛線）和2B5（紅色長(zhǎng)虛線）。

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CDR突變?cè)跍囟纫蕾囆訮EG結(jié)合中的作用

為了確定哪些突變負(fù)責(zé)抗體變體2B5的溫度依賴性結(jié)合，我們將2B5中的保守氨基酸突變（V H V23A和V L K53N）分別還原為親本3.3抗體中的相應(yīng)氨基酸（圖6A）。V H V23還原為丙氨酸并不能消除2B5ΔV與PEG的溫度依賴性結(jié)合（圖6B）。相反，如在4℃，25℃和37℃下通過(guò)2B5ΔK與PEG的類似結(jié)合所觀察到的，用天冬酰胺置換VL K53消除了2B5ΔK與PEG的溫度選擇性結(jié)合（圖6B）。我們得出結(jié)論，V L K53突變負(fù)責(zé)2B5與PEG的溫度依賴性結(jié)合。

圖6. V L鏈K53負(fù)責(zé)2B5與PEG的溫度依賴性結(jié)合。（A）重組2B5或2B5，其中V H V23（2B5ΔV）或V LK53（2B5ΔK）被相應(yīng)的氨基酸取代從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中純化親本3.3抗體。（B）重組2B5（■），2B5ΔK（○的分級(jí)濃度）或2B5ΔV（●）抗體在溫度下添加到涂有線性氨基PEG的微孔板孔中。1小時(shí)后，洗滌孔，并通過(guò)添加HRP綴合的驢抗小鼠IgG Fc抗體，然后添加ABTS底物來(lái)確定抗體結(jié)合。顯示了三次測(cè)定的平均吸光度值（405 nm）。酒吧，SD。

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2B5結(jié)合可以被冠醚模擬的PEG結(jié)構(gòu)

幾項(xiàng)研究報(bào)告說(shuō)，PEG可以配成賴氨酸殘基，在蛋白質(zhì)晶體表面形成冠狀醚樣結(jié)構(gòu)。19 - 21因此，我們假設(shè)，2B5可識(shí)別構(gòu)象PEG可以由冠醚來(lái)模擬（圖7A。 ）。實(shí)際上，在4℃下18-crown-6以劑量依賴的方式*阻斷了固定量的2B5與固定化的甲氧基-PEG 2k -NH 2的結(jié)合（圖7B，上圖）。相比之下，18-crown-6在親本3.3抗體與PEG結(jié)合方面的競(jìng)爭(zhēng)相對(duì)較弱（圖7B，上面板）。18-crown-6不影響同種型匹配的抗β-葡萄糖醛酸苷酶控制抗體（7G8）與固定的β-葡萄糖醛酸苷酶的結(jié)合（圖7B，下圖），證明了競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的特異性。我們進(jìn)一步推斷出，如果18-crown-6模擬在4°C形成的PEG結(jié)構(gòu)，那么2B5應(yīng)該在所有溫度下都與結(jié)構(gòu)明確的18-crown-6結(jié)合。因此，我們通過(guò)表面等離振子共振檢查了2B5與固定在CM5芯片上的2-氨基甲基-18-crown-6在三種不同溫度（4°C，25°C和37°C）下的結(jié)合。2B5在所有測(cè)試溫度下均與固定的18-crown-6結(jié)合，而3.3和7G8抗體分別與固定的18-crown-6結(jié)合或相對(duì)不結(jié)合（圖S2））。同樣地，我們?cè)?°C，25°C和37°C下檢測(cè)到2B5與96孔ELISA板上包被的2-氨基甲基-18-crown-6的結(jié)合（圖7C）。我們得出的結(jié)論是2B5結(jié)合到PEG結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)優(yōu)先在4°C形成，并且可以被18-crown-6模仿。

圖7. 2B5可以結(jié)合冠醚結(jié)構(gòu)。（A）18-crown-6，PEG400和2-氨基甲基-18-crown-6的化學(xué)結(jié)構(gòu)的圖示。（B）將梯度濃度的18-crown-6在4°C與10μg/ mL 3.3（○），2B5（■）或7G8（●）抗體混合，然后添加到涂有氨基PEG的96孔板中2k -NH 2（上圖）或β-葡萄糖醛酸苷酶（下圖）。結(jié)果顯示抗體結(jié)合以大結(jié)合活性的百分比表示。（n = 3）。條形圖，SD（C）純化的3.3（○）的分級(jí)濃度），2B5（■）或7G8（●）抗體在涂有2-aminomethyl-18-crown-6的微孔板孔中于4°C，25°C或37°C孵育。4小時(shí)后，洗滌孔并通過(guò)加入生物素綴合的山羊抗小鼠IgG Fc抗體和鏈霉親和素-生物素化的過(guò)氧化物酶復(fù)合物，然后加入ABTS底物來(lái)確定抗體結(jié)合。顯示了三次測(cè)定的平均吸光度值（405 nm）。酒吧，SD。

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2B5抗體對(duì)PEG化納米顆粒的熱親和純化

我們進(jìn)一步探討了是否可以將2B5抗PEG抗體用于PEG化化合物的輕度親和純化。將冷PBS（4°C）中的PEG-Qdots上樣到裝有瓊脂糖珠的柱子上，瓊脂糖珠的表面共價(jià)連接有3.3或2B5抗體（圖8A）。用冷PBS洗滌色譜柱后，用檸檬酸鹽緩沖液（pH = 3.0）或37°C PBS洗脫P(yáng)EG-Qdot。3.3和2B5抗體均可在低溫下捕獲PEG-Qdot。用37°C PBS洗脫從2B5色譜柱中釋放PEG-Qdot，而從3.3色譜柱洗脫P(yáng)EG-Qdots需要進(jìn)行酸洗脫（圖8B）。這些結(jié)果表明，2B5可通過(guò)在4°C至37°C之間簡(jiǎn)單地?zé)嵫h(huán)來(lái)溫和純化PEG化化合物。

圖8. PEG化化合物的輕度親和純化。（A）PEG-Qdot655的溫度依賴性親和純化的示意圖。（B）將氧化的3.3或2B5抗體固定在Hydrarazide樹(shù)脂上并裝填到柱中。將PEG-Qdot655送入色譜柱，然后用冷PBS（4°C）洗滌色譜柱，然后用37°C PBS或檸檬酸鹽緩沖液（pH = 3.0）洗脫。在IVIS 200光學(xué)成像系統(tǒng)（Xenogen）上檢測(cè)到PEG-Qdot655的熒光。

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抗體的原位分類開(kāi)關(guān)重組

從IgM到生發(fā)中心其他抗體類別的抗體重鏈基因的CSR也取決于AID活性。22因此，我們檢查了AID的表達(dá)是否可以促進(jìn)類轉(zhuǎn)換抗體的分離。pCMV-AID- loxP載體用于通過(guò)慢病毒感染穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)AGP4和3D8雜交瘤細(xì)胞。AGP4雜交瘤細(xì)胞分泌與PEG結(jié)合的單克隆IgM，而3D8雜交瘤細(xì)胞分泌與小鼠B16F10黑色素瘤細(xì)胞表面表達(dá)的抗原結(jié)合的單克隆IgM。23，24將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)4周，然后用熒光標(biāo)記的PEG（AGP4雜交瘤細(xì)胞）和PE偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG（AGP4和3D8雜交瘤細(xì)胞）對(duì)活的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色，然后通過(guò)FACS將單個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞分選到96孔培養(yǎng)板的各個(gè)孔。通過(guò)ELISA檢查了AGP4 / loxP- AID和3D8 / loxP- AID克隆的培養(yǎng)基中抗體的重鏈類型。如所期望的，在親代AGP4和3D8雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中僅檢測(cè)到IgM抗體（圖9A和B）。相比之下，所有選定的AGP4 / loxP -AID和3D8 / loxP-AID雜交瘤克隆分泌了IgG抗體，證實(shí)了從IgM到IgG的類別轉(zhuǎn)換。AGP4和3D8類轉(zhuǎn)換抗體的同種型的進(jìn)一步分析表明，它們都是IgG 3。如通過(guò)ELISA確定的，類別轉(zhuǎn)換的抗體保留了抗原結(jié)合活性（圖9C和D）。但是，對(duì)類別轉(zhuǎn)換的3D8抗體的重鏈可變區(qū)基因進(jìn)行測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)AID共有熱點(diǎn)中的氨基酸發(fā)生了變化（表S1），表明在CSR期間也發(fā)生了SHM。我們得出的結(jié)論是，模仿生發(fā)中心反應(yīng)可以促進(jìn)同時(shí)發(fā)生SHM的IgM向IgG抗體的快速轉(zhuǎn)化。

圖9.雜交瘤細(xì)胞中的快速重鏈類別轉(zhuǎn)換。（A）將AGP4 / loxP- AID細(xì)胞培養(yǎng)4周，然后通過(guò)將單個(gè)細(xì)胞的熒光激活細(xì)胞分選到96孔板的孔中來(lái)克隆對(duì)表面IgG染色呈陽(yáng)性的細(xì)胞。顯示了來(lái)自親本AGP4細(xì)胞和十個(gè)AGP4 / loxP- AID克隆的培養(yǎng)基中抗體的重鏈類別。（B）通過(guò)將單個(gè)細(xì)胞的熒光激活細(xì)胞分選到96孔板的孔中來(lái)克隆顯示表面IgG的3D8 / loxP- AID細(xì)胞。顯示了來(lái)自親本3D8細(xì)胞和三個(gè)3D8 / loxP- AID克隆的培養(yǎng)基中抗體的重鏈類型。（C）通過(guò)ELISA在涂有PEG或?qū)φ?beta;-葡萄糖醛酸苷酶抗原（n = 2）的平板中測(cè)定了來(lái)自十個(gè)所選AGP4 / loxP -AID克隆的培養(yǎng)基中AGP4 IgM或IgG抗體的平均結(jié)合率。Bars，SD（D）使用B16F10細(xì)胞作為抗原來(lái)源，通過(guò)FACS確定3D8，三個(gè)3D8 / loxP -AID克隆或?qū)φ誂GP4雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中抗體的結(jié)合。

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細(xì)胞系和試劑

FO骨髓瘤細(xì)胞（PTA-11450），51個(gè)BALB / 3T3小鼠成纖維細(xì)胞（CCL-163），CC49（抗TAG-72的IgG 1 mAb，HB-9459），L6（抗人L6抗原的IgG 2a mAb，HB-8677） ，BC3（抗人CD3ε鏈的IgG 2b mAb，HB-10166）和PEG-1-6（抗流感病毒的Cg -189 IgG 3 mAb）雜交瘤細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)GP4（針對(duì)聚乙二醇的IgM mAb），3.3和6–3（針對(duì)聚乙二醇的IgG 1 mAb），7G8（針對(duì)人β-葡糖醛酸糖苷酶的IgG 1mAb）和3D8（針對(duì)B16F10黑色素瘤的IgM mAb）得到開(kāi)發(fā)。我們的實(shí)驗(yàn)室，并進(jìn)行了描述。24，52，賴明宗博士（中國(guó)科學(xué)院分子生物學(xué)研究所）友善提供了53枚人類293FT細(xì)胞。將所有細(xì)胞在Dulbecco氏補(bǔ)充有2.98克/ L HEPES，將2克/ L的NaHCO改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)3，10％胎牛血清（HyClone公司），100U / mL青霉素和100μg/ mL鏈霉素，在37℃下，在空氣中含5％CO2的加濕氣氛。甲氧基-PEG750-NH2，甲氧基-PEG1K-NH2，甲氧基-PEG2K-NH2，甲氧基-PEG3K-NH2羥基-PEG5K-NH2，甲氧基-PEG10K-NH2，甲氧基-PEG 20K -NH 2（750，1000，2000，3000，5000，10 000，20 000道爾頓，分別地），4-臂聚（環(huán)氧乙烷）10K -NH 2，2-氨基甲基-18-冠-6和18-crown-6購(gòu)自Sigma-Aldrich。

DNA質(zhì)粒構(gòu)建

質(zhì)粒pAS4w.1.Ppuro（圖S3）包含用于強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)基因表達(dá)的四環(huán)素響應(yīng)元件啟動(dòng)子（TRE）（Tet-on系統(tǒng)），pLKO_AS3w.Ppuro（圖S4）和pLKO_AS3w.Pneo（圖。S5），其含有CMV早期增強(qiáng)子/雞β肌動(dòng)蛋白（CAG）啟動(dòng)子用于cDNA的基因表達(dá)，和pLKO_AS3w.Ppuro-EGFP（圖S6），其中包含一個(gè)EGFP基因，是慢病毒載體。這些質(zhì)粒與pCMVΔR8.91包裝質(zhì)粒54和pMD.G VSV-G包膜質(zhì)粒55一起從國(guó)家RNAi核心實(shí)驗(yàn)室（中國(guó)科學(xué)院基因組研究中心分子生物學(xué)研究所）獲得。為了生成可終止的鼠類AID（AID）表達(dá)系統(tǒng)，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)loxP側(cè)翼為loxP -CMV-AID-HA-F2A-eGFP- loxP表達(dá)盒（pCMV-AID-loxP）。通過(guò)RT-PCR從BALB / c小鼠分離的脾細(xì)胞中克隆了HA標(biāo)記的鼠激活誘導(dǎo)的脫氨酶（AID-HA）DNA的片段。為了監(jiān)測(cè)AID-HA的表達(dá)，使用了基于弗林蛋白酶2A（F2A）56的雙順?lè)醋颖磉_(dá)策略，將增強(qiáng)的綠色熒光蛋白（eGFP基因）連接到AID-HA基因的下游。從pLNCX-抗-PEG-eB7擴(kuò)增含有HA標(biāo)簽和eGFP基因的一部分的HA-F2A-eGFP片段。57還通過(guò)PCR從pLNCX-抗-PEG-eB7克隆了CMV啟動(dòng)子。通過(guò)PCR從pLKO_AS3w.Ppuro-eGFP克隆了eGFP片段。然后通過(guò)組裝PCR從CMV，AID-HA和F2A-eGFP片段中創(chuàng)建CMV-AID-HA-F2A-eGFP盒，并插入pLKO_AS3w.Ppuro質(zhì)粒中，其中CAG啟動(dòng)子被CMV啟動(dòng)子替換。為了引入loxP位點(diǎn)，將退火的寡核苷酸分別插入CMV啟動(dòng)子上游的Spe I位點(diǎn)和eGFP下游的Pme I位點(diǎn)。將所得的質(zhì)粒pCMV-AID-loxP與pMD.G和pCMVΔR8.91共轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中，以產(chǎn)生重組慢病毒，該慢病毒用于感染雜交瘤細(xì)胞以將AID基因引入基因組。

我們還構(gòu)建了可誘導(dǎo)的AID表達(dá)載體。通過(guò)PCR從pRetroX-Tet-On Advanced（Clontech Laboratories，Inc.）擴(kuò)增rtTA-M2，然后使用多點(diǎn)定向誘變58進(jìn)行突變，以獲得rtTA-V14基因，該基因僅需10 ng / mL多西環(huán)素即可達(dá)到相似的效果在Tet-on系統(tǒng)中，當(dāng)強(qiáng)力霉素為1000 ng / mL時(shí)，基因誘導(dǎo)水平為野生型rtTA。17通過(guò)組裝PCR產(chǎn)生了IRES-rtTA-V14片段。將Nhe I-Pme I消化的AID-HA-F2A-eGFP片段和IRES-rtTA-V14片段插入pAS4w.1.Ppuro，以創(chuàng)建pAS4w.1.Ppuro-AID-F2A-eGFP-IRES-rtTA-V14 ，表示為pTetOn-AID。

從pDsRed2（Clontech Laboratories，Inc。）擴(kuò)增出編碼DsRed2基因的DNA的片段，并插入到pLKO_AS3w.Pneo中以產(chǎn)生pAS3w.Pneo-DsRed2。通過(guò)使用QuikChange TM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖校⊿tratagene）進(jìn)行定點(diǎn)誘變，將琥珀終止密碼子引入核苷酸位置519 18的pAS3w.Pneo-DsRed2中，以產(chǎn)生pDsRed2s。

PEG和β-葡萄糖醛酸苷酶的生物素化

將溶于2 mg / mL DMSO的4arm-PEG 10K -NH 2，甲氧基-PEG 5K -NH 2和甲氧基-PEG 2K -NH 2（Laysan Bio，Arab，AL）與6倍（對(duì)于4arm-摩爾過(guò)量的EZ-link NHS-LC-生物素（Pierce）或AlexaFluor®647琥珀酰亞胺酯（PEG 10K -NH 2）或2倍（對(duì)于甲氧基-PEG 5K -NH 2和甲氧基-PEG 2K -NH 2）摩爾過(guò)量Invitrogen（在DMSO中）在室溫下放置2小時(shí)，以生產(chǎn)生物素化的4arm-PEG 10K或Alexa Fluor 647共軛的甲氧基-PEG 5K和甲氧基-PEG 2K， 分別。這些化合物在DDH的5倍體積稀釋2 O和透析（分子量截止?12個(gè)000-14 000道爾頓）相對(duì)于雙蒸水2 O操作除去游離EZ-鏈路NHS-LC-生物素或Alexa氟647。同樣，將人β-葡萄糖醛酸苷酶59以2 mg / mL的濃度溶于PBS（pH 8.0）中，然后在室溫下與20倍摩爾過(guò)量的EZ-link NHS-LC-生物素混合2小時(shí)，以產(chǎn)生生物素化的β-葡糖醛酸糖苷酶。加入十分之一體積的1M甘氨酸溶液以終止反應(yīng)。將生物素化的β-葡萄糖醛酸苷酶對(duì)PBS進(jìn)行透析，以除去游離的EZ-link NHS-LC-生物素，進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾并保存在-80°C。

雜交瘤細(xì)胞膜結(jié)合免疫球蛋白的分析

小鼠免疫球蛋白在活雜交瘤細(xì)胞上的表面表達(dá)是通過(guò)用2μg/ mL山羊抗小鼠Ig（ICN Pharmaceuticals）或山羊抗大腸桿菌抗體（Abcam）對(duì)含有0.05％BSA的PBS進(jìn)行陰性對(duì)照染色來(lái)測(cè)量的在4°C下放置1小時(shí)。將細(xì)胞用冷PBS洗滌3次，并用2μg/ mL FITC綴合的兔抗-（山羊IgG F（ab）' 2）抗體（ICN Pharmaceuticals）染色。3.3和7G8雜交瘤細(xì)胞也用生物素化的4arm-PEG 10K染色（0.5 nM）或生物素化的β-葡萄糖醛酸苷酶（5μg/ mL）在漢克平衡鹽溶液（HBSS），2％FBS中在4°C下放置30分鐘，然后用Alexa Fluor 647偶聯(lián)的抗生蛋白鏈菌素（2μg/ mL）（Jackson ImmunoResearch Laboratories）在4°C下放置30分鐘。通過(guò)用冷PBS洗滌兩次除去未結(jié)合的探針。在BD™LSR II流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson）上測(cè)量10 4個(gè)活細(xì)胞的表面熒光，并用Flowjo（Tree Star）進(jìn)行分析。

慢病毒將AID基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入雜交瘤細(xì)胞

通過(guò)使用45μLTransIT-LT1轉(zhuǎn)染試劑將7.5μgpCMV- AID-loxP或pTetOn-AID與6.75μgpCMVΔR8.91包裝質(zhì)粒54和0.75μgpMD.G VSV-G包膜質(zhì)粒55共轉(zhuǎn)染來(lái)包裝重組慢病毒顆粒。（Mirus Bio）在10厘米培養(yǎng)皿（90％融合度）中生長(zhǎng)的293FT細(xì)胞中。48小時(shí)后，收集慢病毒顆粒，并通過(guò)在4°C下以50 000xg超速離心1.5小時(shí)進(jìn)行濃縮。將慢病毒顆粒懸浮在含有5μg/ mL聚乙烯的培養(yǎng)基中，并通過(guò)0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾。將雜交瘤細(xì)胞接種在6孔板中（1×10 5病毒感染前一天）。將含有慢病毒的培養(yǎng)基添加到細(xì)胞中，然后將其離心1.5 h（500xg，32°C）。在含有嘌呤霉素（5μg/ mL）的*培養(yǎng)基中選擇細(xì)胞，以產(chǎn)生穩(wěn)定的3.3 / loxP -AID，AGP4 / loxP -AID或3D8 / loxP -AID細(xì)胞。

細(xì)胞中AID的條件表達(dá)

在存在或不存在強(qiáng)力霉素的情況下，通過(guò)在3.3 / loxP -AID和3T3 / TetOn-AID細(xì)胞中檢測(cè)eGFP報(bào)告基因，在BD™LSR II流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson）上測(cè)量細(xì)胞中AID的相對(duì)表達(dá)水平。為了檢查是否可以停止AID表達(dá)，在電穿孔溶液（Mirus Bio）中用5μgpLM-CMV-mCherry-P2A-Cre 60 DNA（Addgene）轉(zhuǎn)染了3.3 / loxP -AID雜交瘤細(xì)胞（2.5×10 6個(gè)細(xì)胞）使用BTX電穿孔儀（275電壓，15毫秒脈沖長(zhǎng)度）。將細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)48小時(shí)，然后在BD™LSR II流式細(xì)胞儀上分析eGFP和mCherry熒光。轉(zhuǎn)染pLM-CMV-mCherry-P2A-Cre 3.3 / loxPDNA轉(zhuǎn)染后10天，在FACSAria細(xì)胞分選儀上分離出eGFP表達(dá)陰性的-AID細(xì)胞。要直接測(cè)量細(xì)胞中的AID蛋白水平，請(qǐng)使用5×10 6將3.3或3.3 / loxP-AID雜交瘤細(xì)胞在0.5 mL RIPA緩沖液（1％NP-40、150 mM NaCl，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，50 mM Tris，pH 8.0）中于4°C裂解1小時(shí)。通過(guò)12.5％還原SDS-PAGE分析澄清裂解物中的50μg總蛋白，將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素紙上，并依次用針對(duì)HA表位標(biāo)簽序列YPYDVPDYA（載體實(shí)驗(yàn)室）或兔抗微管蛋白α的生物素化山羊抗HA抗體染色抗體（NeoMarkers），然后分別是抗生蛋白鏈菌素-HRP和山羊抗兔Ig-HRP（Jackson ImmunoResearch Laboratories）。通過(guò)ECL檢測(cè)（Pierce）可視化條帶，并使用LAS-3000 Mini Fujifilm成像系統(tǒng)（FujiFilm）分析條帶。

SHM分析

用DsRed2s慢病毒感染3T3或3T3 / TetOn-AID細(xì)胞，以生成3T3 / DsRed2s或3T3 / TetOn-AID x DsRed2s細(xì)胞。在有或沒(méi)有500 ng / mL強(qiáng)力霉素的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。在限定的時(shí)間收獲細(xì)胞并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)以測(cè)量DsRed2信號(hào)，該信號(hào)指示過(guò)早終止密碼子的突變以允許全長(zhǎng)DsRed2蛋白的表達(dá)。計(jì)算DsRed2陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，并報(bào)告為回復(fù)體/ 10 6個(gè)細(xì)胞。

通過(guò)模擬生發(fā)中心反應(yīng)分離抗PEG抗體變體

為了分離抗PEG抗體變體，將3×10 7 3.3 / loxP-AID細(xì)胞培養(yǎng)兩周，然后在HBSS，2％FBS中用生物素化的4arm-PEG 10K（100 pM，1×10 6細(xì)胞/ mL）染色在4°C孵育30分鐘，然后在4°C與5 mL的Alexa Fluor 647偶聯(lián)的抗生蛋白鏈菌素（2μg/ mL）和PE偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG Fc抗體（2μg/ mL）孵育30分鐘測(cè)量膜結(jié)合的免疫球蛋白水平。通過(guò)用冷PBS洗滌兩次除去未結(jié)合的探針。在FACSAria細(xì)胞分選儀上收集顯示高Alexa Fluor 647熒光的細(xì)胞（占總細(xì)胞的1％），并培養(yǎng)2周，然后再次分選細(xì)胞。PEG鏈的長(zhǎng)度和PEG探針的分支從4arm-PEG 10K逐漸降低，線性PEG 5K和線性PEG 2K。5輪后，將單個(gè)3.3 / AID細(xì)胞收集到96孔板中，并通過(guò)將pLM-CMV-mCherry-P2A-Cre瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到雜交瘤克隆中來(lái)終止AID表達(dá)。

抗體生產(chǎn)與純化

在15 mL培養(yǎng)基（DMEM，5％FBS）中將2.5×10 7的所選3.3 / loxP -AID變異雜交瘤細(xì)胞（1E3和2B5）接種到CELLine CL 1000兩室生物反應(yīng)器（INTEGRA Biosciences AG）中。每7天收獲含抗體的培養(yǎng)基，然后通過(guò)蛋白A Sepharose 4 Fast Flow色譜法（GE Healthcare）純化。收集的抗體針對(duì)PBS進(jìn)行透析，并進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾?？贵w濃度通過(guò)雙辛可寧酸（BCA）蛋白測(cè)定法（Thermo Scientific）確定。

抗體2B5的定點(diǎn)誘變

通過(guò)RT-PCR從2B5雜交瘤cDNA中克隆了重組2B5抗體基因。2B5輕鏈和重鏈DNA通過(guò)pLNCX-抗PEG-eB7中的復(fù)合弗林蛋白酶2A雙順?lè)醋颖磉_(dá)肽接頭連接。將經(jīng)EcoR I-Pme I消化的2B5 IgG片段插入pAS3w.Ppuro中以產(chǎn)生pAS3w.Ppuro-2B5。V H V23A和V L的定點(diǎn)誘變K53N在50μL混合物中進(jìn)行，混合物包含20 ng pAS3w.Ppuro-2B5模板DNA質(zhì)粒，每個(gè)引物15 pmole，dNTPs 20 nmole，2 U Phusion高保真DNA聚合酶（Thermo Scientific）在1 x Phusion緩沖液中。熱循環(huán)在95°C進(jìn)行0.5分鐘的初始變性; 在95°C下進(jìn)行18個(gè)循環(huán)0.5分鐘，在55°C下進(jìn)行1分鐘，在68°C下進(jìn)行11分鐘。冷卻至≤37°C后，將2 U Dpn I限制酶（NEB）直接添加到37°C的擴(kuò)增反應(yīng)中1.5 h。通過(guò)熱激法，將四微升Dpn I消化的樣品用于轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生穩(wěn)定分泌2B5 / V23A（2B5ΔV）和2B5 / K53N（2B5ΔK）抗體的3T3細(xì)胞，并如上所述在嘌呤霉素（10μg/ mL）中進(jìn)行選擇。

抗體ELISA

將Maxisorp 96孔微孔板（Nalge-Nunc International，Roskilde，丹麥）用0.5μg/孔的甲氧基-PEG 750 -NH 2，甲氧基-PEG 1K -NH 2甲氧基-PEG 2K -NH 2，甲氧基-PEG 3K-包被。 NH 2羥基-PEG 5K -NH 2，甲氧基-PEG 10K -NH 2，甲氧基-PEG 20K -NH 2或4臂聚環(huán)氧乙烷10K -NH 2（50μL/孔）0.1 M NaHCO 3 / Na 2一氧化碳3（用HCl調(diào)節(jié)至pH 8.0）緩沖液在37°C下放置3小時(shí)，然后在4°C下用200μL/孔稀釋緩沖液（PBS中5％脫脂奶）封閉過(guò)夜。將抗體在37°C下預(yù)孵育長(zhǎng)達(dá)5 d，以檢查熱穩(wěn)定性。將在50μL2％脫脂乳中的PBS中濃度分級(jí)的抗體在4°C，RT或37°C下添加1小時(shí)。將板分別用PBS在4℃，RT或37℃下洗滌3次。在4°C，RT或37°C下將50μL稀釋緩沖液中的HRP偶聯(lián)驢抗小鼠IgG Fc（2μg/ mL）加入1小時(shí)。如上所述洗滌板。為了進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性ELISA分析，將maxisorp 96孔微孔板用0.5μg/孔的氨基PEG 2K -NH 2包被?；蛉缟纤龅娜?beta;-葡糖醛酸糖苷酶。制備了從120 mM開(kāi)始的18-crown-6的3倍系列稀釋液，并與20μg/ mL的3.3、2B5或7G8抗體1：1（v / v）混合（因此抗體的終濃度為10μg / mL）。將混合物在4℃下添加到板中1小時(shí)。將板在4℃下用PBS洗滌3次，然后在4℃下與綴合有HRP的驢抗小鼠IgG Fc（2μg/ mL）一起溫育1小時(shí)。對(duì)于冠醚ELISA分析，如上所述，將maxisorp 96孔微孔板用0.5μmol/孔2-氨基甲基-18-crown-6包被。在4°C，25°C或37°C下，將50μL2％脫脂乳的PBS中的抗體（3.3、2B5或7G8）的分級(jí)濃度添加到板中4小時(shí)。將板分別用PBS在4℃，25℃或37℃下洗滌兩次。在4°C，25°C或37°C下將50μL稀釋緩沖液中的生物素偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG Fc（2μg/ mL）（Jackson ImmunoResearch Laboratories）添加1小時(shí)。如上所述在不同溫度下洗滌板。將5微克生物素化的過(guò)氧化物酶（Invitrogen）和10μg鏈霉親和素（Thermo Scientific）在室溫下于15 mL PBS中預(yù)孵育30分鐘，以允許形成復(fù)合物，然后將50μL加入孔中。未結(jié)合的抗體在4°C，25°C或37°C下用PBS洗滌四次。在所有情況下，通過(guò)加入150μL/孔ABTS溶液[0.4 mg / mL，2,2'-疊氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），0.003％H 將5微克生物素化的過(guò)氧化物酶（Invitrogen）和10μg鏈霉親和素（Thermo Scientific）在室溫下于15 mL PBS中預(yù)孵育30分鐘，以允許形成復(fù)合物，然后將50μL加入孔中。未結(jié)合的抗體在4°C，25°C或37°C下用PBS洗滌四次。在所有情況下，通過(guò)加入150μL/孔ABTS溶液[0.4 mg / mL，2,2'-疊氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），0.003％H 將5微克生物素化的過(guò)氧化物酶（Invitrogen）和10μg鏈霉親和素（Thermo Scientific）在室溫下于15 mL PBS中預(yù)孵育30分鐘，以允許形成復(fù)合物，然后將50μL加入孔中。未結(jié)合的抗體在4°C，25°C或37°C下用PBS洗滌四次。在所有情況下，通過(guò)加入150μL/孔ABTS溶液[0.4 mg / mL，2,2'-疊氮基雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），0.003％H在室溫下用2 O 2和100 mM檸檬酸磷酸酯（pH 4.0）處理30分鐘。在酶標(biāo)儀（Molecular Device）中測(cè)量孔的吸光度（405nm）。

IgG的Fab片段化

將木瓜蛋白酶（Sigma-Aldrich）溶解在補(bǔ)充有20mM 1-半胱氨酸和20mM EDTA（PBS-Sigma）的PBS中的終濃度為0.1mg / mL，然后將pH調(diào)節(jié)至7.2。將等體積的純化的3.3、1E3或2B5抗PEG抗體（2 mg / mL）添加到木瓜蛋白酶溶液中，并在37°C下孵育2.5小時(shí)。加入十分之一體積的0.3M碘乙酰胺溶液（Sigma-Aldrich）以終止反應(yīng)。通過(guò)在PEG親和柱上進(jìn)行親和色譜純化3.3、1E3和2B5抗PEG Fab片段，方法是將1g CNBr活化的Sepharose 4B（GE Healthcare）在1 mM HCl（pH 3）中溶脹30分鐘，然后用偶聯(lián)緩沖液（0.1 M NaHCO 3，pH 8.3）并加入五摩爾甲氧基-PEG 30K-mL胺（Laysan Bio）/ mL凝膠在偶聯(lián)緩沖液中于25°C放置4 h。通過(guò)在25°C下向凝膠中添加1/10體積的1M Tris（pH 8），封閉CNBr活化的瓊脂糖凝膠上剩余的活性基團(tuán)2小時(shí)。將PEG偶聯(lián)的Sepharose用含有0.5M NaCl的0.1M乙酸鹽緩沖液（pH 4）洗滌，然后用含有0.5M NaCl的0.1M Tris（pH 8）洗滌。將木瓜蛋白酶消化的抗體在4°C上樣到PEG-樹(shù)脂柱上45分鐘，并用冷PBS洗滌以去除木瓜蛋白酶和Fc片段。用100 mM甘氨酸緩沖液（pH 3）洗脫結(jié)合PEG-樹(shù)脂的抗PEG Fab片段，并用PBS透析。

雞蛋清溶菌酶的聚乙二醇化

三毫克/毫升雞蛋白溶菌酶（HEL）（Sigma-Aldrich公司）的PBS（pH8.0）中，用4倍摩爾過(guò)量的甲氧基PEG的混合2K在25 2小時(shí)-succinimidylpropionate（為Shearwater Polymers提供）℃至生產(chǎn)單聚乙二醇化的HEL（PEG 2k-HEL）。加入十分之一體積的1M甘氨酸溶液以終止反應(yīng)。通過(guò)在Sephacryl S-300 HR柱上的凝膠過(guò)濾除去未反應(yīng)的PEG。PEG 2k -HEL的濃度通過(guò)BCA測(cè)定（Thermo Scientific），以牛血清白蛋白作為參考蛋白來(lái)確定。

通過(guò)表面等離振子共振分析抗PEG抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)

在4℃，25℃和37℃下，在Biacore T-200（GE Healthcare）上測(cè)量3.3，1E3和2B5抗PEG Fab片段的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)程序通過(guò)EDC / NHS反應(yīng)進(jìn)行胺偶聯(lián)，將PEG 2k -HEL固定在CM5芯片（GE Healthcare）上?？偣补潭?7個(gè)共振單元（RUs）。在HEPES緩沖鹽水中以各種濃度的抗體以65μL/ min的恒定流速確定結(jié)合。

抗體的熱穩(wěn)定性

將抗體在PBS中透析，脫氣，然后以0.5 mg / mL的濃度添加到差示掃描量熱儀（Nano DSC III）（TA Instruments）的樣品室中。將脫氣的PBS注入?yún)⒈仁摇Ｔ趯⒚總€(gè)抗體-緩沖液對(duì)在3 atm的固定壓力下以每分鐘1°C的速率從10°C線性加熱到110°C時(shí)，監(jiān)測(cè)差分功率。還使用與抗體樣品相同的步驟收集緩沖液（脫氣的PBS）掃描進(jìn)行基線扣除。

通過(guò)表面等離振子共振將抗體與冠醚結(jié)合

在確定的溫度下，在Biacore T-200（GE Healthcare）上測(cè)量抗體對(duì)18-crown-6化合物的結(jié)合活性。通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)程序通過(guò)EDC / NHS反應(yīng)進(jìn)行胺偶聯(lián)，將2-氨基甲基-18-皇冠-6固定在CM5芯片上。以10μL/ min的恒定流速將2-aminomethyl-18-crown-6（10 mM在50 mM硼酸鈉緩沖液中，pH 8.5）注射到EDC / NHS活化的CM5芯片中，持續(xù)30分鐘。通過(guò)注射乙醇胺使剩余的琥珀酰亞胺酯失活?？偣补潭?79.4個(gè)共振單位（RUs）。在4°C，25°C和37°C的HEPES緩沖鹽水中，以1μM的抗體以50μL/ min的恒定流速進(jìn)行抗體結(jié)合分析。

通過(guò)抗PEG抗體親和純化PEG化的納米顆粒

通過(guò)在抗PEG抗體樹(shù)脂柱上的親和色譜法純化PEG-Qdot655納米顆粒。簡(jiǎn)短地，將偶聯(lián)緩沖液（0.1 M乙酸鈉，0.15 M氯化鈉，pH 5.5）中的5 mg 3.3或2B5抗PEG抗體與10 mM偏高碘酸鈉（Thermo Scientific Pierce）在室溫下于黑暗中反應(yīng)， 30分鐘。在Zeba™Spin脫鹽柱上除去偏高碘酸鈉，然后將氧化的抗體與1 mL含0.1 M苯胺的Ultradid Hydrazide樹(shù)脂（Thermo Scientific）在室溫下孵育4小時(shí)。將抗PEG樹(shù)脂填充到柱中，并用PBS洗滌3次。將500微升PEG-Qdot655溶液（在PBS中為32 nM）在4°C加載到3.3或2B5抗PEG色譜柱中。用冷PBS洗滌柱，并用37℃PBS或100mM檸檬酸鹽緩沖液（pH ＝ 3）洗脫結(jié)合的PEG-Qdot655納米顆粒。將顆粒轉(zhuǎn)移到Nunc F96 MicroWell黑色聚苯乙烯板（200μL/孔）中，并在IVIS 200光學(xué)成像系統(tǒng)（Xenogen）上檢測(cè)到PEG-Qdot655的熒光（激發(fā)/發(fā)射：450 nm / 660 nm）。

免疫球蛋白ELISA

將Maxisorp 96孔微孔板用0.5μg/孔的山羊抗小鼠IgG + IgA + IgM（Jackson ImmunoResearch Laboratories）包被在50μL/孔的0.1 M NaHCO 3 / Na 2 CO 3中（用HCl調(diào)節(jié)至pH 8.0）緩沖液在37°C下放置3小時(shí)，然后在200°L /孔的稀釋緩沖液（PBS中5％脫脂奶）中在4°C封閉過(guò)夜。將在50μL2％脫脂牛奶（1：100）中稀釋的雜交瘤上清液在室溫下加入板中1小時(shí)。將板用PBS洗滌3次。在室溫下將HRP偶聯(lián)的兔抗小鼠IgG，IgA或IgM（MP Biomedicals，2μg/ mL）加入50μL稀釋緩沖液中1小時(shí)。如上所述洗滌板。通過(guò)在室溫下添加150μL/孔ABTS溶液30分鐘來(lái)測(cè)量結(jié)合的過(guò)氧化物酶活性。在酶標(biāo)儀中測(cè)量孔的吸光度（405 nm）。根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用Mouse MonoAb-ID試劑盒（Zymed Laboratories）確定類別轉(zhuǎn)換的AGP4和3D8抗體的同種型。

類轉(zhuǎn)換3D8抗體變體的FACS分析

將B16F10細(xì)胞在4°C下用3D8或3D8 / loxP-AID細(xì)胞的培養(yǎng)上清液染色30分鐘。將細(xì)胞用冷PBS洗滌3次，并用2μg/ mL PE-綴合的PE-抗山羊IgG Fc抗體（Jackson ImmunoResearch Laboratories）染色。通過(guò)用冷PBS洗滌兩次除去未結(jié)合的抗體。在BD™LSR II流式細(xì)胞儀上測(cè)量10 4個(gè)活細(xì)胞的表面熒光，并用Flowjo進(jìn)行分析。